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商品描述
TEV蛋白酶的效率和高特异性使其广泛用于重组融合蛋白的切割。然而，野生型的TEV蛋白酶由于其低溶解性和自噬作用阻碍了TEV蛋白酶在大肠杆菌中的产生。本表达质粒是根据参考文献(Journal of Biotechnology 121 (2006) 291–298)构建的一种高效、稳定的突变体表达质粒，可以用于实验室His、GST等标签的切除。本表达载体带有HIS标签，可以用镍离子树脂进行纯化。本产品将以干粉的形式提供，收到后请加10-20ul的超纯水进行溶解后再进行转化。
1、转化
1.1 恒温水浴锅设置温度为 42°C。
1.2 从-80°C 取出 100ml 感受态大肠杆菌放置冰面融化。
1.3 加入 1μL 质粒至 100ml 感受态大肠杆菌中，用枪头轻轻搅拌，冰浴放置 30min。
1.4 热休克: 42°C 水浴热击 60-70 秒，然后再冰浴 2min。
1.5 加入 900ml LB 培养液，再放入摇床孵育 1.5h （37°C，180rpm）。
1.6 离心：8000rpm，5min，弃 2/3 上清，余 1/3 上清混悬细胞沉淀并转移到带有抗生素
的 LB 培养板上。
2、表达
培养基: TB
抗生素: Kanamycin (50μg/ml) , Chloramphenicol (34μg/ml)
接种比例: 15 ml/l medium
表达系统: BL21 (DE3)
培养基体积: 3000ml
Day 1: 当天下午将转化的菌落接种到含有 LB 的试管中在 30 °C, 175 RPM 条件下培养
过夜。
Day 2: 过夜菌液接种到大培的培养基中，在 37°C 下培养至 OD600~2 时温度降至 18°C，
然后等到 OD600~3 时用 0.5 mM IPTG 进行诱导表达，大概表达 12-16 小时进行收
菌，收菌时在 4500g 的离心力下离心 10min，离心后的细胞短期保存在-20°C，长期
保存在-80°C。
3、纯化
3.1 将细胞在 IMAC lysis buffer 和 complete stock solution 中按以下比例浑悬
IMAC lysis buffer (1.5 ml buffer per gram cell pellet) and the complete stock solution (1 ml
per 1.5 l culture) were added and the cell pellets were re-suspended on a shaker table (cold
room).
3.2 细胞浑悬液按照以下方法进行超声裂解
超声 4s/停止 4s，总共 10 min, 70% amplitude
3.3 按以下方法离心
20 min at 49000 xg，用 0.45 μm 滤膜进行过滤
3.4 用镍离子树脂进行纯化
首先用 IMAC wash 1 buffer 分别进行冲洗，然后用 IMAC elution buffer 将蛋白洗脱。
3.5 用 Gel Filtration Column 进行进一步纯化
IMAC lysis buffer: 100mM HEPES, 500mM NaCl, 10% glycerol, 10mM imidazole, 0.5mM
TCEP, pH 8.0
IMAC wash 1 buffer: 20mM HEPES, 500mM NaCl, 10% glycerol, 10mM imidazole, 0.5mM
TCEP, pH 7.5
IMAC wash 2 buffer: 20mM HEPES, 500mM NaCl, 10% glycerol, 50mM imidazole, 0.5mM
TCEP, pH 7.5
IMAC elution buffer: 20mM HEPES, 500mM NaCl, 10% glycerol, 500mM imidazole, 0.5mM
TCEP, pH 7.5
Gel filtration buffer: 20mM HEPES, 300mM NaCl, 10% glycerol, 0.5mM TCEP, pH 7.5Final Storage buffer: 20mM HEPES, 300mM NaCl, 10% glycerol, 0.5mM TCEP, pH 7.5
3.6 冻存
以 2mg/mL 的浓度进行分装，然后用液氮冷冻并保存在-80°C
4、酶切
将 TEV 按照摩尔比 30:1 (蛋白：TEV)混合，然后在 4’C 下酶切过夜（~16hours）
使用说明
| 购买人 | 会员级别 | 数量 | 属性 | 购买时间 |
|---|
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